细胞培养入门教程,细胞培养用液的配制与消毒

2019-08-23 11:21栏目:生命科学

核心提示:常用设备准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜、储品规(放置消毒过

核心提示:常用设备准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜、储品规(放置消毒过

核心提示:器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。 具体步骤:一 . 水的

常用设备

常用设备

器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素 . 纯净水系统、电子天平、 PH 计、磁力搅拌器。

准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜、储品规、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。

准备室的设备:单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜、储品规、包装台。配液室的设备:扭力天平和电子天平、PH计(测量培养用液PH值)、磁力搅拌器(配置溶液室搅拌溶液)。

具体步骤:

培养室的设备:液氮罐、储品柜、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱、空调、二氧化碳缸瓶、边台。必须放在无菌间的设备:离心机、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱(放置serum和培养用液)。

培养室的设备:液氮罐、储品柜、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱、空调、二氧化碳缸瓶、边台。必须放在无菌间的设备:离心机、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱(放置serum和培养用液)。

一 . 水的制备:

无菌操作

无菌操作无菌室的灭菌:1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱灭菌:先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌:用75%酒精擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水。

无菌室的灭菌:1.定期打扫无菌室:每周打扫一次,先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等,然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5%过氧乙酸擦拭。2.CO2孵箱灭菌:先用3‰新洁尔灭擦拭,然后用75%酒精擦拭或者0.5%过氧乙酸,再用紫外灯照射3.实验前灭菌:打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌:用75%酒精擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。

实验人员的无菌准备:1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75%酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示:1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿要放在高处,使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。

二 .PBS 的制备与消毒 :

实验人员的无菌准备:1.肥皂洗手。2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75%酒精棉球擦净双手。无菌操作的演示:1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿要放在高处,使用时仍要过火。5.各种操作要靠近酒精灯,动作要轻、准确,不能乱碰。如吸管不能碰到废液缸。6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管,防止交叉污染。

器械的清洗和消毒玻璃器械洗消:

  1. 溶解定容:将药品( NaCl 8.0g , KCl 0.2g , Na2HPO4·H2O 1.56g , KH2PO40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至 1000ml ,摇匀即成新配制的 PBS 溶液。

  2. 移入溶液瓶内待消毒:将 PBS 倒入溶液瓶内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内 8 磅 消毒 20 分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

器械的清洗和消毒

一、新的玻璃器皿的洗消:1.自来水刷洗,除去灰尘。2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸包装。6.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干

三 . 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:

玻璃器械洗消:一、新的玻璃器皿的洗消:1.自来水刷洗,除去灰尘。2.烘干、泡盐酸:烤箱中烘干,然后再浸入5%稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。3.刷洗、烘干:12小时后立即用自来水冲洗,再用洗涤剂刷洗,自来水冲干净后用烤箱烘干。4.泡酸、清洗:用清洁液(重铬酸钾120g:浓硫酸200ml:蒸馏水1000ml)浸泡12小时,然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次,最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。5.烘干、包装:洗干净后先烘干,然后用牛皮纸包装。6.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内盖好盖子,打开开关和安全阀,当蒸气成直线上升时,关闭安全阀,当指针指向15磅时,维持20-30分钟。7.高压消毒后烘干

二、旧的玻璃器皿的洗消:1.刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液,12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)5.烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压消毒,再烘干备用。

胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在 pH 为 8.0 、温度为 37℃ 时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因 Ca2 、 Mg2 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含 Ca2 、 Mg2 的 BSS ,如: D-Hanks 液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。

二、旧的玻璃器皿的洗消:

橡胶和塑料:橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上,然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。2. 胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水处理30分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。3. 胶帽,离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时,自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。4. 胶头可用75%酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。5.塑料培养瓶,培养板,冻存管:6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70%酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2―3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000―100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时__这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。

  1. 称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为 0.25 %,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调 PH 到 7.2 左右)或 PBS ( D-hanks )液中。搅拌混匀,置于 4℃ 内过夜。

  2. 金沙国际官网,用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器( 0.22 微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于 -20℃ 保存以备使用。

1.刷洗、烘干:使用过的玻璃器皿可直接泡入来苏尔液或洗涤剂溶液中,泡过来苏尔溶液的器皿要用清水刷洗干净,然后烘干。2.泡酸、清洗:烘干后泡入清洁液,12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗(避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗),再用蒸馏水冲洗3次。3.烘干、包装:洗干净的器皿烘干后取出用牛皮纸等包装,以便于消毒储存及防止灰尘和再次被污染。4.高压消毒:包装好的器皿装入高压锅内,盖好盖子,打开开关和安全阀,随着温度的上升安全阀冒出蒸气,当蒸气成直线冒出3-5分钟后,关闭安全阀,气压表指数随之上升,当指针指向15磅时,调节电开关维持20-30分钟即可。(玻璃培养瓶消毒前可将胶帽轻轻盖上)5.烘干备用:因为高压消毒后器皿会被蒸气打湿,所以要放入烤箱内烘干备用。金属器械洗消:金属器皿不能泡酸,洗消时可先用洗涤剂刷洗,后用自来水冲干净,然后用75%酒精擦拭,再用自来水,然后用蒸馏水冲洗,再烘干或空气中晾干。放入铝制盒内包装好在高压锅内15磅高压消毒,再烘干备用。

注意事项:1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。2.安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。

四 . 抗生素溶液的配制

橡胶和塑料:橡胶和制品通常处理方法是:先用洗涤剂洗刷干净,再分别用自来水和蒸馏水冲干净,再用烤箱烘干,然后根据不同品质进行如下的处理程序:1 . 针式滤器帽不能泡酸液,用NaOH泡6-12小时,或者煮沸20分钟,在包装之前要装好滤膜两张,安装滤膜时注意光面朝上,然后将螺旋稍微拧松一些,放入铝盒中在高压锅内15磅30分钟消毒,再烘干备用。注意在超净台内取出使用时应该立即将螺旋旋紧。2. 胶塞烘干后用2%氢氧化钠溶液煮沸30分钟(用过的胶塞只要用沸水处理30分钟),自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。3. 胶帽,离心管帽烘干后只能在2%氢氧化钠溶液中浸泡6-12小时,自来水洗净,烘干。然后再泡入盐酸液30分钟,再用自来水,蒸馏水,三蒸水洗净,烘干。最后装入铝盒内高压消毒,烘干备用。4. 胶头可用75%酒精浸泡5分钟,然后紫外照射后使用即可。5.塑料培养瓶,培养板,冻存管:6.其他消毒方法:有的物品既不能干燥消毒,又不能蒸气消毒,可用70%酒精浸泡消毒。塑料培养皿打开盖子,放在超净台台面上,直接暴露在紫外线下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品,消毒后需要用2—3周时间洗除残留的氧化乙烯。用20000—100000rad的r射线消毒塑料制品效果最好。为了防止清洗器材已消毒与末消毒发生混淆,可在纸包装后,用密写墨水作好标记。其法即用沾水笔或毛笔沾以密写墨水,在包装纸上作一记号,平时__这种墨水不带痕迹,一经高温,即出现字迹,从而可以判定它们是否消毒。密写墨水的配制:氯化钻2g,30%盐酸10m1,蒸馏水88m1。

细胞培养用液的配制与消毒器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

  1. 所用纯净水需要 15 磅 高压 20 分钟灭菌。

  2. 具体操作均在超净台内完成。青霉素是 80 万单位 / 瓶,用注射器加 4ml 灭菌双蒸水。链霉素是 100 万单位 / 瓶,加 5ml 灭菌双蒸水,即每毫升各为 20 万单位。

  3. 使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为 100 单位 /ml 。 1 单位= 1 微克?

  4. 细胞库之细胞培养基不加抗生素

注意事项:1.严格执行高压锅的操作规程:高压消毒时,先检查锅内是否有蒸馏水,以防高压时烧干,水不能过多因为其将使空气流畅受阻,会降低高压消毒效果。检查安全阀是否通畅,以防高压时爆炸。2.安装滤膜时注意光面朝上:注意滤膜光滑一面是正面,要朝上,否则起不到过滤的作用。3.注意人体的防护和器皿的完全浸泡:A.泡酸时要戴耐酸手套,防止酸液溅起伤害人体。B.从酸缸内捞取器皿时防止酸液溅到地面,会腐蚀地面。C.器皿浸入酸液中要完全,不能留有气泡,以防止泡酸不彻底。

具体步骤:

5.培养自ATC引进之细胞株,培养基中不加抗生素。

细胞培养用液的配制与消毒

一. 水的制备:细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

  1. 培养自其它实验室引进之细胞株,制作token freeze 前培养基须添加抗生素,待token freeze 通 过污染测试后,大量培养时则不加抗生素。

  2. 寄送活细胞时,须将培养液充满整个 flask 时,则须添加抗生素 。

  3. 若要检测mycoplasma,则培养基内不可添加gentamicin,因gentamicin 会抑制 mycoplasma 生长。

  4. 去除细菌污染之抗生素混合配方 : penicillin 250 units/ml, streptomycin 250 ug/ml, neomycin 250 ug/ml, bacitracin 2.5 units/ml 注意混合使用后药物毒性会增强。

  5. 抗生素使用种类与浓度:

器材与试剂:干粉型培养基、胰蛋白酶,青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器。

二.PBS的制备与消毒:1.溶解定容:将药品(NaCl 8.0g,KCl 0.2g,Na2HPO4・H2O 1.56g,KH2PO40. 2g )倒入盛有双蒸水的烧杯中,玻璃棒搅动,充分溶解,然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml,摇匀即成新配制的PBS溶液。2.移入溶液瓶内待消毒:将PBS倒入溶液瓶内,盖上胶帽,并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。

工作浓度. 储存温度. 杀灭细菌 penicillin 100 units/ml -20℃ G bacteria streptomycin 100 ug/ml -20℃ G and G bacteria chlotetracycline 50 ug/ml -20℃ G and G bacteria gentamicin 50 ug/ml -20℃ G and G bacteria, mycoplasma amphotericin B 2.5 ug/ml -20℃ yeast and molds nystatin 50 ug/ml -20℃ yeast and molds fungizone 2.5ug/ml -20℃ yeast and molds

具体步骤:

三. 胰蛋白酶溶液的配制与消毒:胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关,在pH为8.0、温度为37℃时,胰酶溶液的作用能力最强。使用胰酶时,应把握好浓度、温度和时间,以免消化过度造成细胞损伤。因Ca2 、Mg2 和血清、蛋白质克降低胰酶的活性,所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2 、Mg2 的BSS,如:D-Hanks液。终止消化时,可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。1.称取胰蛋白酶:按胰蛋白酶液浓度为0.25%,用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水(若用双蒸水需要调PH到7.2左右)或PBS液中。搅拌混匀,置于4℃内过夜。2.用注射滤器抽滤消毒:配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器(0.22微米微孔滤膜)抽滤除菌。然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。

五 .RPMI1640 的制备与消毒:

一. 水的制备:细胞培养用水必须非常纯净,不含有离子和其他的杂质。需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水

四.青、链霉素溶液的配制于消毒1. 所用纯净水需要15磅高压20分钟灭菌。2.具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万单位/瓶,用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万单位/瓶,加5ml灭菌双蒸水,即每毫升各为20万单位。3.使用时溶入培养液中,使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。1单位=1微克?

  1. 溶解、调 PH 值、定容:先将培养基粉剂加入培养液体积 2/3 的双蒸水中 , 并用双蒸水冲洗包装袋 2-3 次 , 充分搅拌至粉剂全部溶解 , 并按照包装说明添加一定的药品 . 然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各 0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为 100 单位 /ml 。然后用一个当量的盐酸和 NaOH 调 PH 到 7.2 左右。最后定容至 1000ml ,摇匀。

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